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微生物限度檢驗(薄膜過濾法)驗證詳解

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微生物限度檢查包含定量和定性評估,定量指需氧菌和霉菌酵母菌總數,定性則指不得含控制菌。常用方法包括常規法、靜置上清液法、培養基稀釋法等,其中薄膜過濾法和平皿法常用于微生物回收和計數。

中國、美國和歐洲藥典均有微生物限度標準,但具體限度有所不同,分別針對不同類別產品制定。總之,微生物限度是確保產品質量和安全的關鍵指標,通過嚴格檢測和控制可有效預防微生物污染風險。

主要針對微生物限度檢驗(薄膜過濾法)菌液的稀釋與制備、微生物計數方法學驗證、控制菌驗證及再驗證等展開介紹。

驗證用菌株及菌種要求

驗證用菌株 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌作為細菌計數驗證用菌株,需確保生物學特性穩定,傳代次數不超過5代。

菌種保藏技術 為確保試驗菌株的生物學特性,應采用適宜的菌種保藏技術,如冷凍干燥或液氮冷凍等,并嚴格控制傳代次數。

霉菌及酵母菌驗證 黑曲霉和白色念珠菌作為霉菌及酵母菌計數驗證用菌株,同樣需遵循生物學特性,并應用合適的保藏技術。

需氧菌菌液制備及稀釋

細菌菌液培養 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌菌液制備,接種至10ml胰酪大豆胨液體培養基,30~35℃培養18~24小時。

細菌稀釋 取各個細菌培養液1ml分別加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10^-6~10^-7(具體稀釋級需要進行驗證),制成每1ml含菌數50~100cfu的菌懸液。

霉菌及酵母菌菌液制備

白色念珠菌培養及稀釋 接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml沙氏葡萄糖液體培養基中,20~25℃培養 24~48小時;取此培養液1ml加 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 9ml。采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-6~10-7,制成每1ml含菌數 50~100cfu的菌懸液

黑曲霉孢子懸液制備 加入3~5ml 含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,使用渦旋儀將洗脫液進行混勻。準備一個無菌注射器內部塞入無菌棉球,再將洗脫液進行過濾,過濾好的菌懸液取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法。稀釋至10-4~10-6,制成每1ml含孢子數50~100cfu的孢子懸液,為確保試驗的準確性,所有菌液和孢子懸液的制備均需嚴格遵守無菌操作規程。

黑曲霉孢子懸液制作注意事項

  1. 黑曲霉孢子容易污染潔凈環境,在進行黑曲霉孢子懸液制備時建議關閉生物安全柜風機,防止孢子擴散。

  2. 菌絲去除:確保去除菌絲,否則會影響后續實驗。

微生物計數方法學驗證

供試液的制備

無抑菌活性供試品 稀釋劑為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,液體供試品需與稀釋劑按1:10比例混合均勻,固體、半固體、粘稠性供試品則按1:10比例混合稀釋劑。

培養基稀釋法 取供試液2ml,每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿;或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿,傾注15ml的培養基,測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數。

離心沉淀集菌法 取一定量的供試液,3000轉/分離心20分鐘(供試液如有沉淀,先以500轉/分鐘離心5分鐘,取全部上清液再離心),棄去上清液,留底部集菌液約2ml,加稀釋液補至原量。

薄膜過濾法 取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾,沖洗,按薄膜過濾法測定其菌落數,選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當的對氨基苯甲酸,含重金屬的藥物在培養基內加入巰基化合物。

試驗組檢測方法(無抑菌活性供試品為例)

無菌濾杯中,再加入1ml不大于100cfu的菌懸液過濾。最后再用300ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜(每次100ml,沖3次)。過濾結束后,接種金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌的濾膜貼在胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)上,平行制備兩份。接種白色念珠菌和黑曲霉的濾膜貼在2個胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)上和2個沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)上。

菌液組檢測方法(無抑菌活性供試品為例)

取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml加入準備好濾膜的無菌濾杯中,再加入1ml不大于100cfu的菌懸液過濾。最后再用300ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜(每次100ml,沖3次)。過濾結束后,接種金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌的濾膜貼在胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)上,平行制備兩份。接種白色念珠菌和黑曲霉的濾膜貼在2個胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)上和2個沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)上。

供試品對照組及稀釋級對照組檢測方法(無抑菌活性供試品為例)

供試品對照組 取10ml供試液過濾,再用300mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(每次100ml,沖3次),不加試驗菌,操作同試驗組,測供試品本底數。

稀釋劑對照組(陰性對照) 用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml替代供試液,操作同試驗組。

培養和計數 含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)平板倒置于30~35℃培養箱中培養3~5天;含白色念珠菌、黑曲霉的胰酪大豆胨瓊脂培養基平板(TSA)倒置于20~25℃培養箱中培養5~7天;含白色念珠菌、黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)平板倒置于20~25℃培養箱中培養5~7天;供試品對照組中胰酪大豆胨瓊脂培養基平板倒置于30~35℃培養箱中培養2天,觀察結果后,延長培養至3 天;供試品對照組中沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板倒置于20~25℃培養箱中培養3天。 觀察菌落生長情況,點計菌落數。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。

點計菌落數后,計算平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級別兩個平板的菌落平均數不小于15,則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。

試驗組回收率計算 回收率計算試驗組回收率計算的關鍵在于明確試驗組與對照組的菌落數關系,確保數據準確;通過回收率驗證,確保試驗方法的可靠性和準確性,為藥品微生物限度檢驗提供有力支持。

計數方法驗證結果菌回收率計算公式:試驗組的菌回收率在(0.5~2.0),照該供試液制備方法和計數法測定供試品的需氧菌、 霉菌及酵母菌數;若任一次試驗中試驗組的菌回收率不在(0.5~2.0)范圍內,應采用 其他方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。方法適用性確認時,若采用的上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那么選擇最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。

控制菌驗證

驗證菌株信息

大腸埃希菌(Esherichia coli)【CMCC(B) 44102】

金黃色葡萄球菌( Staphylococcus)【CMCC(B)26003】

乙型付傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)【CMCC(B) 50094】

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)【CMCC (B) 10104】

菌株保藏要求 驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代 (從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代),并采用適宜的菌種保藏技術,以保證試驗菌株的生物學特性。

菌液制備(以大腸埃希菌為例)

菌液制備方法 取1環大腸埃希菌新鮮TSA斜面培養物接種至胰酪大豆胨液體培養基(TSB)中,30~35℃培養18~24小時。

菌液稀釋制備 分別取培養液 1ml加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨溶液,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-5~10-7,制成每1ml含菌數10~100cfu的菌懸液。

驗證過程(大腸埃希菌) 試驗組:取1:10的供試液10ml加入濾杯,再加入1ml不大于100cfu的大腸埃希菌菌懸液過濾。最后再用300mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜(每次100ml,沖3次)。過濾結束后,將濾膜接種至裝有100mlTSB的無菌錐形瓶中。于30~35℃培養18-24h,觀察結果。取上述培養物1ml 接種至100ml麥康凱液體培養基(MCB)中,42~44℃培養24小時,取麥康凱液體培養物劃 線接種于麥康凱瓊脂培養基(MCA)平板上30~35℃培養18小時。

菌液對照組:取10mlpH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品,其余操作同試驗組。

陰性對照組:取10mpH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品,以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

陰性對照組要求 試驗組、菌液對照組應檢出大腸埃希菌,陰性對照組應未檢出試驗菌,驗證試驗有效,否則應消除供試品的抑菌活性重新驗證。至少應進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌,照該供試液制備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查。

未檢出試驗菌處理 若試驗組未檢出試驗菌,應采用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。

再驗證

藥品組分變化 當藥品的組分發生改變可能影響檢驗結果時,需要進行再驗證。

檢驗條件調整 當驗證時檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,需要進行再驗證。


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